①流式细胞检测样本的制备

前处理系统——流式细胞检测样本的制备

流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，是流式细胞术的基本要求。因此就必须把待检测的 外周血、 实体组织 等样本 制备成单细胞悬液。在应用中，制备出合格的单分散细胞 是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞的方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：

①取材必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位， 组织等标本必须在取材后保持样 本的新鲜，一般 在室温 1 个小时之内处理好样本或及时用固定剂或 28 ℃低温 对组织进行保存；

②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色，制成合适的单细胞悬液；

③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；

④再依照软件提供的程序对检测结果进行检测分析；

⑤检测分析结果在生物、 医学上的意义进行分析和评价。

根据不同的样本来源大致能分为三种情况，以下将会分开简述不同来源下的样本前处理 过程及所涉及的材料和仪器。

一、外周血单细胞悬液的样本制备

血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。血液中的主要细胞类型为单个核的细胞，主要包括白细胞、红细胞、树突状细胞、和其他少量细胞类型， 而其中白细 胞主要成分又分为淋巴细胞（T 细胞、B 细胞）、单核细胞和粒细胞，以淋巴细胞占很大一部分。

制备小Tip：当样本需要使用绝对计数时，悬液是免洗的，即无需离心重悬，染色、溶血、混匀后的悬液可直接上机检测。

二、骨髓细胞单细胞悬液的样本制备

制备小Tip：

（1）从绿头管中取样后，要注意的是需要根据样本的浓度加入生理盐水，调整到合适的浓度。

（2）制备好的骨髓细胞单细胞悬液尽量在24小时内上机检测，避免检测数据出现较大的差异。

三、实体组织样本的处理

目前有越来越多的实验室使用流式细胞仪来研究实体组织和肿瘤的抗原表达，倍体分析和增殖指数，而样本制备的好坏将直接影响到实验结果的可信度。已知常用于分离组织的方法有：化学处理 、酶消化和机械分离，这些方法可单独使用，也可联合使用，但无论哪一种处理都耗时，且对于操作者的安全和单细胞悬液的质量来说，或多或少 都存在 缺陷 。除此之外，制备时 还要考虑组织与组织之间的差异，有些组织的细胞非常易损，有些细胞表面标记对酶处理非常敏感，所以制备 方法的选择 会 直接影响细胞的活力和得率 。 由于操作人员手法的差异，实验结果的可重复性也很差 ，因此在临床上常使用 样本制备仪 来处理实体组织样本 。

样本制备仪的原理与操作：

样本制备仪是是一套安全的，标准化的样本制备系统，可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离，为流式分析、细胞培养、或 DNA 扩增技术提供高质量的样本。整套系统对操作人员的技术要求不高，而且可对各种类型的组织实现标准化的样本处理。目前常见的制备仪有 BD 的 Medimachine 系统、圣泰科（Syntec）的 MediMachineII 单细胞悬液制备系统、美天旎的 GentleMACS 全自动组织处理器。

其原理可简述成下列三点：

① 首先将获得的组织除去脂肪和坏死部分，剪成 10mm³左右的小块和缓冲液（比如 PBS ）一起放入仪器仓中。

② 启动仪器，根据组织的类型和你所需细胞悬液的要求选择仪器运作的时间（从10 秒到 4 分钟不等），对于任何一种组织 和所需的细胞悬液分离的时间都可以标准化，并适用于各个实验室。

③ 组织被分离后，选择合适的孔径筛网来纯化细胞悬液，过滤后的悬液将会进入仪器底部的收集区域。此时可用注射器收集区内回收我们所需的单细胞悬液，完成检测样本的制备。

常见的样本制备仪